Grânulos de stress são agregados de proteínas e RNAs encontrados no citoplasma das células, em geral produzidos em resposta uma forma de stress ambiental. No entanto, diversas doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica e Alzheimer, já foram associadas com inclusões patogênicas desses agregados com consequências nocivas para a célula. Dentre as proteínas presentes no granulo de stress o complexo G3BP1-CAPRIN1-USP10 é essencial para a condensação do granulo e sua associação com subunidades ribossomais, sendo que a expressão ectópica de CAPRIN1 é suficiente para induzir a formação de grânulos. Apesar dos mecanismos moleculares associados aos grânulos não estarem completamente elucidados, uma das principais funções propostas para estas estruturas é a reprogramação da expressão gênica (transcriptoma). Um dos processos transcriptômicos alterados nas situações de stress é o de splicing alternativo. A consequência principal dessa alterações é a modificação da sequência de nucleotídios que irá compor o transcrito final ao modificar as regiões exônicas utilizadas na composição do mRNA. Os processos de splicing alternativo já foram demonstrados ser de vital importância para no processo de resposta a stress em diversos organismos. Entretanto, avaliações em escala global desses eventos em situação de grânulos de stress ainda são carentes em modelos de culturas de células humanas. Resultados preliminares obtidos a partir de sequenciamento de RNA em larga escala (RNAseq), após expressão ectópica de CAPRIN1, apontaram a existência de 1058 eventos de splicing alternativo ocorrendo em transcritos anotados. Também identificamos a existência de 12484 novas isoformas e 875 transcritos não-identificados que podem representar genes novos associados com a formação de grânulos de stress.Nosso trabalho tem como objetivo a identificação, caracterização e anotação desses eventos encontrados no transcriptoma alterado de células com indução de grânulos de stress. Para isso iremos avaliar a existência de grupos funcionais enriquecidos nos transcritos aonde foram identificados exons alternativos, bem como o impacto que esses eventos podem estar ocasionando no transcrito. Em relação as isoformas novas, iremos avaliá-las quanto ao seu potencial codante, presença de elementos repetitivos e alterações na sequência funcional. Para os transcritos desconhecidos, iremos realizar também passo de anotação funcional da sequência. O presente trabalho apresenta a primeira proposta de uma caracterização global de eventos de alteração no transcriptoma em células humanas sob indução de grânulos de stress utilizando dados de RNAseq. (AU)

Proteínas de ligação a RNAs (ou RNA binding proteins- RBPs) exercem regulação celular em várias etapas após a transcrição gênica. A fim de exercerem as funções específicas como regulação de splicing, transporte de RNAs mensageiros e iniciação de tradução proteica as RBPs fazem parte de diferentes complexos proteicos. As proteínas que interagem com as RBPs em cada uma de suas funções, no entanto, são ainda pouco conhecidas. Neste cenário, a elucidação de complexos proteicos formados pelas RPBs e os RNAs alvo destas proteínas irão auxiliar no entendimento do mecanismo básico de regulação da expressão gênica e no entendimento da função das RPBs em processos patológicos. (AU)

As doenças neurodegenerativas representam um problema crescente da atualidade, a medida que a longevidade de nossa população está aumentando, no entanto ainda não se conhece bem o mecanismo biológico da maioria destas. Nesta classe de doenças estão Alzheimer's, Parkinson, Huntington e Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). Falhas na sequência e regulação de DNA e em passos no metabolismo de mRNA (RNAs mensageiros) e de proteínas apresentam relação com a causa e o desenvolvimento dessas doenças. Dentre as falhas relacionadas ao processamento de mRNAs em proteínas existem mutações "non-sense" as quais resultam na introdução de um códon de terminação (stop) prematuro na proteína sintetizada. Esses códons devem ser reconhecidos pelo sistema de controle de qualidade celular, para que os mRNAs contendo códons non-sense sejam eliminados, evitando a produção de proteínas truncadas, em geral não-funcionais. O referido mecanismo celular de clivagem de mRNAs non-sense é denominado Non-sense-Mediated Decay (NMD) ou via de vigilância de mRNAs. Falhas em NMD geram proteínas truncadas e seu acúmulo pode ser deletério, como ocorre em câncer e em algumas das doenças neurológicas. Para a doença ELA, sabe-se que uma das principais proteínas envolvidas na doença é a proteína de ligação a RNA e reguladora de splicing, TDP-43. Mutação nesta proteína resulta em aumento na quantidade de mRNAs defeituosos no cérebro, demonstrando que esta proteína também pode estar envolvida na limpeza de mRNAs defeituosos. Como hipótese para este projeto, sugerimos que mRNAs truncados presentes na doença ELA podem sofrer acúmulo decorrente da baixa atividade do processo de NMD no cérebro. Estes mRNAs resultariam no acúmulo de proteínas defeituosas, tóxicas para os neurônios. Especificamente em ELA, nós questionamos se esses mRNAs deveriam ter sido degradados por NMD para que a doença fosse evitada. O acúmulo destes mRNAs defeituosos decorrentes da falha na função de TDP-43 pode ser um dos motivos pelos quais TDP-43 mutado, detectado na doença ELA, é tóxico para as células. Nós queremos investigar a presença de mRNAs truncados no cérebro de camundongos e também bloquear a via de NMD em cultura de células para verificar a gama de mRNAs acumulados. Desta forma, propomos que uma maior detecção de mRNAs truncados no cérebro de camundongos comparado com outros tecidos possa indicar que este mecanismo esta falho no cérebro e assim relacionado as doenças. Propomos que o bloqueio induzido da via de NMD em células resultará na estabilização e no acúmulo dos transcritos mutados. Este estudo poderá permitir a identificação de genes que contêm mutações non-sense e a avaliação se estes estão relacionados com o mecanismo das doenças neuronais.

Proteínas de ligação ao RNA (RNA binding proteins - RBPs) regulam pós-transcricionalmente um vasto número de genes. Ligam-se a vários mRNAs celulares regulando splicing, localização, estabilização e degradação de transcritos e atuam como guias na regulação gênica por RNAs curtos não-codificantes, como microRNAs. Mutações nas RBPs ou alterações na regulação de mRNAs-alvo são associadas a estados patológicos e com falhas na manutenção da pluripotência de células-tronco e de processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda não está claro o mecanismo de atuação de algumas RBPs nem seus mRNAs-alvo. No presente estudo iremos investigar os mRNAs-alvo ligados a proteína Caprin-1 (ou Rng-105) e definir os sítios de ligação da proteína aos mRNAs.

Proteínas de ligação a RNA (RNA Binding Proteins - RBPs) regulam pós-transcricionalmente um vasto número de genes. Ligam-se a vários mRNAs celulares regulando splicing, localização, estabilização e degradação de transcritos e atuam como guias na regulação gênica por RNAs curtos não-codificantes, como microRNAs. Mutações nas RBPs ou alterações na regulação de mRNAs-alvo são associadas a estados patológicos e com falhas na manutenção da pluripotência de células-tronco e de processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda não se conhece bem o mecanismo de atuação das RBPs nem seus mRNAs-alvo. Deste modo, o presente estudo visa identificar os mRNAs-alvo ligados a proteína Caprin-1 (ou Rng-105) além de definir os sítios de ligação da proteína aos mRNAs. A proteína Caprin-1 é uma fosfoproteína citoplasmática que possui domínio RGG, típico de RBPs. Essa proteína captura mRNAs em grânulos-complexos de alta densidade (grânulos de RNA), localizados no citoplasma de células para que possam ser rapidamente recrutados para a síntese proteica. É altamente expressa em tecidos neuronais e parece ter um papel importante na tradução localizada de mRNAs que são levados do corpo celular aos dendritos resultando em proteínas necessárias para o desenvolvimento dos mesmos e plasticidade sináptica. Para este estudo, será empregada a técnica de CLIP-seq (Crosslinking Immunoprecipitation of RBPs followed by RNA-seq), um método que começou a ser aplicado recentemente em larga escala no estudo bioquímico de interações proteína-mRNAs com a introdução de RNA-seq. Basicamente, o método consiste em realizar crosslinking por irradiação UV de células, imunoprecipitação do complexo proteína-mRNAs, fragmentação e seleção de mRNAs ligados a proteína, seguida de sequenciamento de nova geração. Os dados de CLIP-seq serão avaliados por ferramentas computacionais para identificar o conjunto de mRNAs-alvo e os prováveis sítios de ligação, definidos pelas regiões do transcriptoma com alta densidade de sequências. Será realizada a superexpressão da RBP de interesse em células HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) para otimização da técnica de CLIP e validação dos alvos. Pretende-se desta forma, obter insights sobre a regulação de mRNAs em grânulos celulares e validar eventos regulatórios pós-transcricionais relacionados às RBPs. (AU)

A comunicação com o público, especialmente a divulgação científica, e a internacionalização são dois dos principais desafios da universidade contemporânea. A internet e a web 2.0, com suas ferramentas de interatividade, podem auxiliar as instituições de ensino superior nesses dois objetivos. O presente projeto visa divulgar os trabalhos realizados pelos pesquisadores do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biociências da Unicamp aproveitando-se do potencial da internet reformulando o website do Programa. O website atuará também como plataforma de atualização de notícias sobre descobertas científicas de interesse da comunidade. Além disso as informações sobre o programa de pós-graduação estarão estruturadas de modo claro para poderem ser facilmente acessível por estudantes de todo o Brasil e estrangeiros. A divulgação das pesquisas será feita também por meio da revista eletrônica ComCiência, editada pelo Labjor em parceria com a SBPC, para ampliar o alcance a um público mais amplo.

A comunicação com o público, especialmente a divulgação científica, e a internacionalização são dois dos principais desafios da universidade contemporânea. A internet e a web 2.0, com suas ferramentas de interatividade, podem auxiliar as instituições de ensino superior nesses dois objetivos. O presente projeto visa divulgar os trabalhos realizados pelos pesquisadores do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biociências da Unicamp aproveitando-se do potencial da internet reformulando o website do Programa. O website atuará também como plataforma de atualização de notícias sobre descobertas científicas de interesse da comunidade. Além disso, as informações sobre o programa de pós graduação estarão estruturadas de modo claro para poderem ser facilmente acessível por estudantes de todo o Brasil e estrangeiros. A divulgação das pesquisas será feita também por meio da revista eletrônica ComCiência, editada pelo Labjor em parceria com a SBPC, para ampliar o alcance a um público mais amplo. (AU)

A TDP-43 é uma das proteínas envolvidas com o processo de splicing, transformando os pre-mRNAs em mRNAs maduros. Quando essa proteína apresenta mutações, esse processo pode ser comprometido e os transcritos gerados a partir dele podem apresentar erros. Dentre as falhas relacionadas ao processo de splicing existem as mutações chamadas "non-sense", as quais resultando na introdução de um códon de terminação (stop-codon) prematuro no mRNA maduro. Esses códons deveriam ser reconhecidos pelo sistema de controle de qualidade celular conhecido como Nonsense- Mediated Decay (NMD) ou via de vigilância de mRNAs. Esses transcritos devem ser eliminados pela via de NMD, evitando assim a produção de proteínas truncadas em geral não-funcionais. Quando esse sistema de controle de qualidade falha ocorre um acúmulo dos transcritos defeituosos, o que pode ser deletério para a célula pois as proteínas defeituosas podem formar agregados que apresentam toxicidade celular. Esse acumulo de agregados é característico de doenças neurodegenerativas como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). Como hipótese para este projeto, sugerimos que mRNAs truncados presentes na doença ELA podem sofrer acúmulo decorrente da baixa atividade do processo de NMD no cérebro, devido a ação do microRNA mir-128 presente nos tecidos neuronais. Propomos que o bloqueio induzido da via de NMD em células resultará na estabilização e no acúmulo dos transcritos mutados. A fim de estudarmos esse mecanismo, iremos combinar dados públicos de bioinformática com experimentos de expressão gênica. Experimentalmente, iremos avaliar se a maior presença de mRNAs truncados em tecidos de cérebro de camundongos comparado com outros tecidos pode explicar a falha de NMD e sua relação com doenças. (AU)

Há uma preocupação generalizada com a impressão de ineficiência na produção de medicamentos: apenas 1 em cada 50 compostos testados avança para um medicamento aprovado. As razões são inúmeras, mas as mais preocupantes são relacionadas com a hipótese terapêutica: para colocarmos um medicamento em uso, não temos conhecimento suficiente sobre a biologia da doença que nos permita prever com confiança as conseqüências de uma intervenção. Nenhuma empresa ou laboratório acadêmico pode realizar esta pesquisa por conta própria.FAPESP, UNICAMP e SGC lançaram o novo Centro de Biologia de Quinases, SGC-UNICAMP, coordenado pelo Prof. Paulo Arruda, focando em proteínas quinases com baixo número de estudos em humanos e em plantas. Os laboratórios em Campinas estão totalmente operacionais, e tal como os outros laboratórios em Oxford, Toronto, Chapel Hill e Estocolmo, terão o compromisso de manter os resultados no modelo de ciência aberta à comunidade.O SGC-UNICAMP terá foco no estudo de um grupo de proteinas quinases que regulam processamento de RNA, como o objetivo de desenvolver pequenas moléculas. Esta é uma nova linha de pesquisa, baseada na conservação das proteínas quinases como reguladores-chave em todos os seres vivos superiores. Em Campinas, nós iremos avançar os estudos de proteínas quinases humanas e também de seus ortólogos em plantas, especialmente de pequenas moléculas inibidoras de quinases.onde os palestrantes apresentam seus resultados mais recentes para o grupo e para a comunidade interessada. Neste evento pretendemos juntar 5 experts de referência mundial em biologia e química farmacêutica de proteinas quinases e inibidores para essas proteinas. Estes palestrantes irão nos dar uma visão realista do estado-da-arte das pesquisar em inibidores de quinases. (AU)

Proteínas quinases são uma família de enzimas intimamente envolvidas no controle de uma variedade de processos biológicos. Sua atividade catalítica compreende na transferência de um grupo fosfato da adenosina trifosfatada (ATP) para substratos proteicos contendo resíduos de aminoácidos tirosina, serina e/ou treonina. Para entender a função de cada uma das ~500 qinases e seu efeito nos substratos, pesquisadores tem usado abordagens genéticas de forma a inibir a ação de quinases. Uma das classes de quinases menos estudas são as MRCKs, que estão envolvidas no processo de regulação do citoesqueleto actomiosina, necessário no processo associado com a invasão e metástase celular. Neste projeto usaremos a química medicinal como estratégia para inibição química, a fim de investigarmos o significado terapêutico das quinases subexploradas MRCKa, MRCKb, MRCKg (DMPK2). Nosso objetivo será planejar e sintetizar moléculas que possam interagir de forma potente e seletiva com as quinases MRCKs, a fim de compreender seu papel biológico. Nos últimos seis meses, iniciamos testes de ligação em proteínas para candidatos a inibidores de quinases MRCKs e selecionamos potenciais candidatos químicos. Com base nessa triagem, supomos que os derivados pteridínicos e piralozo[3,4-d]pirimidínicos podem atuar como inibidores potentes e seletivos para as quinases MRCKs. A biblioteca de compostos será avaliada através de estudos de relação estrutura-atividade e da co-cristalização com a proteína alvo. Após otimização, os compostos líderes serão avaliados por ensaios biológicos in vitro e em linhagens de células. A seletividade dos compostos líderes será investigada frente a um painel de quinases, cobrindo diferentes ramos no kinoma. Todo o projeto será desenvolvido nos laboratórios do Structural Genomics Consortium (SGC-FAPESP@Unicamp). A síntese dos compostos será feita em estreita interação com a equipe de biologia estrutural, para assim acelerar a descoberta de inibidores de proteínas quinases. Como resultado do projeto, pretendemos gerar potenciais candidatos a sondas químicas e publicá-los no contexto de ciência aberta.

Proteínas quinases fazem parte de uma superfamília de proteínas responsáveis por realizar fosforilações dependentes de ATP. Esse evento representa o principal mecanismo de sinalização pós-transducional, controlando a maioria dos processos celulares. No genoma humano, existem mais de 500 proteínas quinases (quinoma), porém, somente cerca de 10% do quinoma foi estudado a fundo o que restringe o pipeline de desenvolvimento de inibidores de quinases nas indústrias farmacêuticas e na academia. Neste projeto nós temos por objetivo racionalmente planejar e sintetizar novos inibidores para as proteínas quinases SLK e PRP4B. Os inibidores devem ser altamente seletivos para as quinases alvo e provar seu efeito biológico in vitro e em linhagens de células. Nós também iremos avaliar a seletividade dos inibidores contra um painel de 40 quinases representando diferentes ramos na grande família de quinases. Resultados preliminares sugerem que essas quinases estão envolvidas no processo de regulação e remodelagem da cromatina. Os protótipos para o desenvolvimento dos inibidores para SLK e PRP4B serão o esqueleto maleimídico e o composto guia previamente publicado, respectivamente. Essas séries serão avaliadas através de estudos de REA e da co-cristalização com a proteína-alvo e serão, assim, otimizadas. A avaliação da atividade biológica será realizada por ensaios bioquímicos e celulares. Este projeto será desenvolvido dentro do altamente produtivo consórcio SGC-Unicamp (Structural Genomics Corsortium), o qual tem por objetivo acelerar a descoberta de sondas químicas com função de inibidores de quinases. Nós esperamos gerar inibidores químicos altamente seletivas e publicá-los no contexto de ciência aberta (open science) do SGC (PITE FAPESP 2013/50724-5).

Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins RBPs) controlam uma série de eventos celulares pós-transcricionais como splicing alternativo, transporte de pré-mRNAs para fora do núcleo celular, estabilização de mRNAs e a via de microRNAs. Mutações ou alterações na expressão de RBPs vêm sendo associadas a estados patológicos como Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), distrofia muscular miotônica, autismo e Parkinson. Além disso, várias RBPs regulam a manutenção da pluripotência de células tronco e processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda se sabe pouco sobre a função das RBPs na escolha e na regulação de mRNAs-alvo. Neste projeto propomos identificar os complexos nos quais RPBs estão envolvidas, caracterizar seus mRNAs-alvo e definir mecanismo que relaciona estes dois achados. Iremos combinar técnicas moleculares e bioinformática. Propomos estudar 5 RBPs relacionadas `a manutenção do estado pluripotente e a diferenciação neuronal a partir de células tronco humanas, contribuíndo para o entendimento do mecanismo regulatório ao nível de RNA em doenças neurológicas. Iremos caracterizar complexos protéicos formados por RBPs através de imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa, utilizando-se superexpressão de RBPs em células HEK293. Ao mesmo tempo, propomos estudar o estado pluripotente de células tronco embrionárias humanas empregando a técnica de CLIP-seq (crosslinking de células seguida de imunoprecipitação da RBP e seleção de mRNAs ligados a proteína) para identificar os mRNAs-alvo de RBPs. Os dados de CLIP-seq também serão utilizados para identificar sítios de ligação da proteína aos mRNAs, combinando ferramentas computacionais. Pretendemos validar eventos regulatórios pós-transcricionais em células tronco embrionárias humanas comparativamente com células neuronais derivadas das primeiras.

Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins RBPs) controlam uma série de eventos celulares pós-transcricionais como splicing alternativo, transporte de pré-mRNAs para fora do núcleo celular, estabilização de mRNAs e a via de microRNAs. Mutações ou alterações na expressão de RBPs vêm sendo associadas a estados patológicos como Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), distrofia muscular miotônica, autismo e Parkinson. Além disso, várias RBPs regulam a manutenção da pluripotência de células tronco e processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda se sabe pouco sobre a função das RBPs na escolha e na regulação de mRNAs-alvo. Neste projeto propomos identificar os complexos nos quais RPBs estão envolvidas, caracterizar seus mRNAs-alvo e definir mecanismo que relaciona estes dois achados. Iremos combinar técnicas moleculares e bioinformática. Propomos estudar 5 RBPs relacionadas `a manutenção do estado pluripotente e a diferenciação neuronal a partir de células tronco humanas, contribuíndo para o entendimento do mecanismo regulatório ao nível de RNA em doenças neurológicas. Iremos caracterizar complexos protéicos formados por RBPs através de imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa, utilizando-se superexpressão de RBPs em células HEK293. Ao mesmo tempo, propomos estudar o estado pluripotente de células tronco embrionárias humanas empregando a técnica de CLIP-seq (crosslinking de células seguida de imunoprecipitação da RBP e seleção de mRNAs ligados a proteína) para identificar os mRNAs-alvo de RBPs. Os dados de CLIP-seq também serão utilizados para identificar sítios de ligação da proteína aos mRNAs, combinando ferramentas computacionais. Pretendemos validar eventos regulatórios pós-transcricionais em células tronco embrionárias humanas comparativamente com células neuronais derivadas das primeiras.

Assim como proteínas de ligação a DNA regulam a transcrição gênica por formação de complexos protéicos envolvendo fisicamente o DNA, as proteínas de ligação a RNA ("RNA Binding Proteins" ou RBPs) regulam eventos celulares como splicing, edição e processamento de RNA. Falhas nesta regulação resultam em vários processos patológicos, como doenças neurológicas e musculares. Até o momento, os complexos proteicos envolvendo RBPs e a gama de RNAs-alvo das RBPs são pouco conhecidos. No presente projeto, propomos estabelecer no CBMEG-UNICAMP, a área nova do estudo de RPBs, utilizando células tronco embrionárias humanas. Neste projeto propomos: 1) Identificar proteínas que interagem com RBPs formando complexos regulatórios, por espectrometria de massa. 2) Identificar o conjunto de RNAs que são alvos de RBPs em células tronco embrionárias humanas e/ou neurônios, utilizando-se sequenciamento de próxima geração. 3) Mapear e refinar computacionalmente os dados de sequenciamento em larga escala, definindo regiões do transcriptoma com alta densidade de sequências. 4) Caracterizar funcionalmente mRNAs-alvo das proteínas RBPs combinando dados dos objetivos 1 e 3.

Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins RBPs) controlam uma série de eventos celulares pós-transcricionais como splicing alternativo, transporte de pré-mRNAs para fora do núcleo celular, estabilização de mRNAs e a via de microRNAs. Mutações ou alterações na expressão de RBPs vêm sendo associadas a estados patológicos como Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), distrofia muscular miotônica, autismo e Parkinson. Além disso, várias RBPs regulam a manutenção da pluripotência de células tronco e processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda se sabe pouco sobre a função das RBPs na escolha e na regulação de mRNAs-alvo. Neste projeto propomos identificar os complexos nos quais RPBs estão envolvidas, caracterizar seus mRNAs-alvo e definir mecanismo que relaciona estes dois achados. Iremos combinar técnicas moleculares e bioinformática. Propomos estudar 5 RBPs relacionadas `a manutenção do estado pluripotente e a diferenciação neuronal a partir de células tronco humanas, contribuíndo para o entendimento do mecanismo regulatório ao nível de RNA em doenças neurológicas. Iremos caracterizar complexos protéicos formados por RBPs através de imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa, utilizando-se superexpressão de RBPs em células HEK293. Ao mesmo tempo, propomos estudar o estado pluripotente de células tronco embrionárias humanas empregando a técnica de CLIP-seq (crosslinking de células seguida de imunoprecipitação da RBP e seleção de mRNAs ligados a proteína) para identificar os mRNAs-alvo de RBPs. Os dados de CLIP-seq também serão utilizados para identificar sítios de ligação da proteína aos mRNAs, combinando ferramentas computacionais. Pretendemos validar eventos regulatórios pós-transcricionais em células tronco embrionárias humanas comparativamente com células neuronais derivadas das primeiras.

Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins - RBPs) controlam uma série de eventos celulares pós-transcricionais como splicing alternativo, transporte de pré-mRNAs para fora do núcleo celular, estabilização de mRNAs e a via de microRNAs. Mutações ou alterações na expressão de RBPs vêm sendo associadas a estados patológicos como distrofia muscular miotônica, autismo e Parkinson. Além disso, várias RBPs regulam a manutenção da pluripotência de células tronco e processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda se sabe pouco sobre a função das RBPs na escolha e na regulação de mRNAs-alvo. Neste projeto propomos combinar técnicas moleculares e bioinformática para estudar os complexos nos quais RPBs estão envolvidas e para identificar e caracterizar seus mRNAs-alvo. Propomos estudar 5 RBPs relacionadas `a manutenção do estado pluripotente e a diferenciação neuronal a partir de células tronco humanas, contribuíndo para o entendimento de doenças neurológicas. Iremos caracterizar complexos protéicos formados por RBPs através de imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa, utilizando-se superexpressão de RBPs em células HEK293. Ao mesmo tempo, propomos estudar o estado pluripotente de células tronco embrionárias humanas empregando a técnica de CLIP-seq (crosslinking de células seguida de imunoprecipitação da RBP e seleção de mRNAs ligados a proteína) para identificar os mRNAs-alvo de RBPs. Os dados de CLIP-seq também serão utilizados para identificar sítios de ligação da proteína aos mRNAs, combinando ferramentas computacionais. Pretendemos validar eventos regulatórios pós-transcricionais em células tronco embrionárias humanas comparativamente com células neuronais derivadas das primeiras. (AU)

Realizar análise comparativa molecular global do programa genético de diferenciação de vários subtipos neuronais, com o intuito de compreender os eventos-chave da neurogênese, e identificar elementos determinantes da diferenciação de tipos específicos de neurônios, para futuramente utilizar este conhecimento no aumento da eficiência da obtenção de neurônios por diferenciação in vitro a partir de células-tronco, especialmente de subtipos deficientes ou alterados em doenças e malformações humanas.